Invitrogen核/膜系統(tǒng)一、實驗原理：酵母雙雜交系統(tǒng)是在酵母體內通過重建有活性轉錄因子的結構來鑒定蛋白質之間的相互作用。轉錄因子可以和DNA上特異的序列結合而啟動相應基因的轉錄。這種DNA結合與轉錄激活的功能是由轉錄因子上兩個相互獨立的結構域即DNA結合結構域(BindingDomain，BD)和轉錄激活結構域(ActivationDomain，AD)分別來完成的，并且這兩個結構域對于基因的轉錄激活都是必須的。在GAL4系統(tǒng)中利用轉錄因子GAL4的DNA結合結構域GAL4-BD與激活結構域GAL4-AD的特異載體，分別與基因的ORFs融合，轉化酵母細胞。在酵母內表達的蛋白若發(fā)生相互作用時，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結合在一起，從而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結合，激活相應報告基因的表達，在相應的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽性。酵母雙雜交文庫的構建是篩庫的前提，可用于目的蛋白的互作蛋白大規(guī)模篩選分析蛋白質間的相互作用，是現(xiàn)在分子生物學與生物化學常用的手段。二、實驗步驟：1.1RNA提取1.2mRNA分離1.3cDNA初級文庫的構建1.3.1cDNA第一鏈的合成1.3.2cDNA第二鏈的合成1.3.3cDNAadapter的制備1.3.4cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)1.3.5cDNA分級分離1.3.6BP重組1.3.7電轉化大腸桿菌DH10B1.3.8文庫克隆檢測1.3.9文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定1.4cDNA次級文庫的構建1.4.1初級文庫的質粒抽提1.4.2LR重組1.4.3電轉化大腸桿菌DH10B1.4.4文庫克隆檢測1.4.5文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定三、實驗結果：次級文庫庫容大于107，重組率大于90%，平均插入片段大于1kb。Invitrogen核/膜系統(tǒng)一、實驗原理：酵母雙雜交系統(tǒng)是在酵母體內通過重建有活性轉錄因子的結構來鑒定蛋白質之間的相互作用。轉錄因子可以和DNA上特異的序列結合而啟動相應基因的轉錄。這種DNA結合與轉錄激活的功能是由轉錄因子上兩個相互獨立的結構域即DNA結合結構域(BindingDomain，BD)和轉錄激活結構域(ActivationDomain，AD)分別來完成的，并且這兩個結構域對于基因的轉錄激活都是必須的。在GAL4系統(tǒng)中利用轉錄因子GAL4的DNA結合結構域GAL4-BD與激活結構域GAL4-AD的特異載體，分別與基因的ORFs融合，轉化酵母細胞。在酵母內表達的蛋白若發(fā)生相互作用冂時，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結合在一起，從而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結合，激活相應報告基因的表達，在相應的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽性。酵母雙雜交文庫的構建是篩庫的前閂提，可用于目的蛋白的互作蛋白大規(guī)模篩選分析蛋白質間的相互作用，西寧酵母雙雜交文庫構建，是現(xiàn)在分子生物學與生物化學常用的手段。二、實驗步驟：1.1RNA提取1.2mRNA分離1.3cDNA初級文庫的構建1.3.1cDNA第一鏈的合成1.3.2cDNA第二鏈的合成1.3.3cDNAadapter的制備1.3.4cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)1.3.5cDNA分級分離1.3.6BP重組1.3.7電轉化大腸桿菌DH10B1.3.8文庫克隆檢測1.3.9文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定1.4cDNA次級文庫的構建1.4.1初級文庫的質粒抽提1.4.2LR重組1.4.3電轉化大腸桿菌DH10B1.4.4文庫克隆檢測1.4.5文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定三、實驗結果：次級文庫庫容大于107，重組率大于90%，西安淳風生物科技有限公司，淳風生物科技，平均插入片段大于1kb。Invitrogen核/膜系統(tǒng)一、實驗原理：酵母雙雜交系統(tǒng)是在酵母體內通過重建有活性轉錄因子的結構來鑒定蛋白質之間的相互作用。轉錄因子可以和DNA上特異的序列結合而啟動相應基因的轉錄。這種DNA結合與轉錄激活的功能是由轉錄因子上兩個相互獨立的結構域即DNA結合結構域(BindingDomain，BD)和轉錄激活結構域(ActivationDomain，AD)分別來完成的，并且這兩個結構域對于基因的轉錄激活都是必須的。在GAL4系統(tǒng)中利用轉錄因子GAL4的DNA結合結構域GAL4-BD與激活結構域GAL4-AD的特異載體，分別與基因的ORFs融合，轉化酵母細胞。在酵母內表達的蛋白若發(fā)生相互作用時，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結合在一起，西寧酵母雙雜交文庫構建，從而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結合，激活相應報告基因的表達，在相應的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽性。酵母雙雜交文庫的構建是篩庫的前提，可用于目的蛋白的互作蛋白大規(guī)模篩選分析蛋白質間的相互作用，是現(xiàn)在分子生物學與生物化學常用的手段。二、實驗步驟：1.1RNA提取1.2mRNA分離1.3cDNA初級文庫的構建1.3.1cDNA第一鏈的合成1.3.2cDNA第二鏈的合成1.3.3cDNAadapter的制備1.3.4cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)1.3.5cDNA分級分離1.3.6BP重組1.3.7電轉化大腸桿菌DH10B1.3.8文庫克隆檢測1.3.9文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定1.4cDNA次級文庫的構建1.4.1初級文庫的質粒抽提1.4.2LR重組1.4.3電轉化大腸桿菌DH10B1.4.4文庫克隆檢測1.4.5文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定三、實驗結果：次級文庫庫容大于107，重組率大于90%，平均插入片段大于1kb。.淳風生物科技///西寧酵母雙雜交文庫構建